GUTTA » Aptima HPV assay

Aptima HPV assay

Popis

Aptima HPV assay

 

Použitie
Test APTIMA HPV je amplifikačný test cieľovej sondy nukleovej kyseliny pre in vitro kvalitatívnu detekciu E6/E7 vírusovej messengerovej RNA (mRNA) zo 14 vysoko rizikových typov HPV (16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/66/68). Test APTIMA HPV nerozlišuje medzi 14 vysoko rizikovými typmi. Cervikálne klinické vzorky pre Pap test odobrané do skúmaviek ThinPrep obsahujúcich roztok PreservCyt možno analyzovať pomocou testu APTIMA HPV pred spracovaním Pap i po ňom, čo platí aj pre cervikálne vzorky odobrané pomocou odberovej a prepravnej súpravy APTIMA. Tento test možno použiť k testovaniu vzoriek buď systémom priameho odberu do skúmaviek (Direct Tube Sampling – DTS) alebo systémom TIGRIS DTS. Okrem toho možno test použiť v systéme PANTHER k testovaniu cervikálnych vzoriek odobraných pomocou súpravy APTIMA pre odber a prepravu vzoriek.

 

Princípy metódy
Test APTIMA HPV zahŕňa tri hlavné kroky, ktoré sa vykonávajú v jednej skúmavke: zachytenie cieľa a jeho amplifikácia pomocou transkripčne sprostredkovanej amplifikácie (Transcription – Mediated Amplification – TMA), a potom detekcia produktov amplifikácie (amplikonov) pomocou testu hybridizačnej ochrany (Hybridization Protection Assay – HPA). Test zahŕňa vnútornú kontrolu, ktorá monitoruje zachytenie nukleovej kyseliny, amplifikáciu a detekciu, a rovnako chyby operátora alebo prístroja. Klinické vzorky sa odoberajú alebo sú prenášané v skúmavke obsahujúcej roztok, ktorý lýzuje bunky, uvoľňuje mRNA a chráni ich pred rozkladom v priebehu uchovávania. Keď sa vykonáva test APTIMA HPV, cieľová mRNA je zo vzorky izolovaná pomocou záchytných oligomerov, ktoré sa naviažu na magnetické mikročastice. Záchytné oligomery obsahujú sekvencie, ktoré sú komplementárne ku špecifickým oblastiam HPV mRNA cieľových molekúl, a tiež reťazec deoxyadenosinových zbytkov. Počas hybridizačného kroku sa sekvenčne špecifické oblasti záchytných oligomerov viažu na špecifické oblasti cieľovej molekuly HPV mRNA. Komplex záchytného oligomera a cieľa je potom vychytávaný z roztoku znížením teploty reakcie na pokojovú teplotu. Toto zníženie teploty umožňuje hybridizáciu medzi deoxyadenosinovou oblasťou na záchytnom oligomeri a polydeoxythimidinovými molekulami, ktoré sú kovalentne pripojené k magnetickým časticiam. Mikročastice, vrátane zachytených cieľových molekúl HPV mRNA, ktoré sú na ne naviazané, sú zaťažené na stranu reakčnej skúmavky pomocou magnetov a supernatant sa odsaje. Častice sa premyjú, aby sa odstránila reziduálna matrica vzoriek, ktorá môže obsahovať inhibítory amplifikácie. Po dokončení zachytenia cieľa je HPV mRNA amplifikovaná pomocou TMA, čo je metóda amplifikácie nukleovej kyseliny založená na transkripci, ktorá využíva dva enzýmy, reverznú transkriptázu MMLV a polymerázu T7 RNA. Reverzná transkriptáza sa používa k vytvoreniu kópie DNA sekvencie cieľovej mRNA obsahujúcej sekvenciu promotéra pre polymerázu T7 RNA. Polymeráza T7 RNA produkuje viac kópií RNA amplikonov z kópie DNA templátov. Detekcia amplikonov je dosiahnutá metódou HPA využívajúcej jednoreťazcovú sondu nukleovej kyseliny s chemiluminiscenčným označením, ktorá je komplementárna k amplikonu. Značené sondy nukleovej kyseliny hybridizujú špecificky s amplikonom. Selekčná reagencia rozlišuje hybridizovanú sondu od nehybridizovanej deaktiváciou značenia nehybridizovanej sondy. Počas detekčného kroku je svetlo vyžarované z označených hybridov RNA:DNA merané ako fotónové signály v luminometri a intenzita je hlásená ako relatívne svetelné jednotky (RLU). Ku každej reakcii sa pridáva vnútorná kontrola prostredníctvom reagencie pre zachytenie cieľa. Vnútorná kontrola monitoruje zachytenie cieľa, amplifikáciu a detekčné kroky testu. Signál vnútornej kontroly je pri každej reakcii odlíšený od signálu HPV podľa odlišnej kinetiky svetla emitovaného zo sond s rôznym označením. Amplikon špecifický pre vnútornú kontrolu je detekovaný sondou s rýchlou emisiou svetla (blikajúci). Amplikon špecifický pre HPV je detekovaný pomocou sond s relatívne pomalšou kinetikou emisie svetla (žeravý). Dvojitý kinetický test (Dual Kinetic Assay – DKA) je metódou používanou k rozlíšeniu blikajúcich a žeravých signálov.

 

Súvisiace produkty:

Aptima HPV 16 18/45 genotype assay

ThinPrep Pap test